中华人民共和国国家标准
化妆品微生物标准检验方法
粪大肠菌群
Standard methods of microbiological
examination for cosmetics
Fecal coliforms
UDC668.58:576.85.07
GB 7918.3-87
粪大肠菌群细菌来源于人和温血动物的粪便。检出粪大肠菌群表明该化妆品已被粪便污染，有可能存在其他肠道致病菌或寄生虫等病原体的危险。因此粪大肠菌被列为重要的卫生指标菌。
1 方法提要
根据粪大肠菌群所具有的生物特征，如革兰氏阴性无芽孢杆菌在44℃培养24~48h能发酵乳糖产酸并产气，能在选择性培养基上产生典型菌落，能分解氨酸产生靛基质。
2 培养基和试剂
2.1 乳糖胆盐培养基
成分： 蛋白胨 20g
猪胆盐 5g
乳糖 5g
0.4％溴甲酚紫水溶液 2.5ml
蒸馏水 1000ml
制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH到7.4，加入指示剂，混匀，分装试管(每支试管中加一个小倒管)。115℃(101b)20min灭菌。
2.2 双倍浓度乳糖胆盐培养基
按上述乳糖胆盐培养基成分，蒸馏水量不变，其他称分量加倍。
2.3 伊红美蓝(EMB)琼脂
成分： 蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 2g
琼脂 20g
2％伊红水溶液 20ml
0.5％美蓝水溶液 13ml
蒸馏水 1000ml
制作：先将琼脂加到900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000ml。校正pH值为7.2~7.4，分装于烧瓶内，121℃(151b)15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60℃左右以无菌手续加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。
2.4 蛋白胨水(作靛基质试验用)
成分： 蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000ml
制法：将上述成分加热熔化，调pH值为7.0~7.2，分装小试管，高压灭菌121℃(151b)15min。
2.5 靛基质试剂
柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75ml戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25ml。
试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44℃培养24h。沿管壁加柯凡克试剂0.3~0.5ml，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。
注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。
2.6 革兰氏染色法
2.6.1染液制备
2.6.1.1 结晶紫染色液：
结晶紫 1g
95％酒精 20ml
1％草酸铵水溶液 80ml
将结晶紫溶于酒精中，然后与草酸铵溶液混合。
2.6.1.2 革兰氏碘液
碘 1g
碘化钾 2g
蒸馏水 300ml
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。
2.6.1.3 脱色液：95％乙醇。
2.6.1.4 复杂液：
a. 沙黄复杂液：
沙黄 0.25g
95％酒精 10ml
蒸馏水 90ml
将沙黄溶解于酒精中，然后用蒸馏水稀释。
b. 稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95％乙醇100ml，放置过夜，滤纸过滤。取该液10ml，加5％石碳酸水溶液90ml混合，即为石碳酸复红液。再取此液10ml加水90ml，即为稀石碳酸复红液。
2.6.2染色法
2.6.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。
2.6.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
2.6.2.3 滴加95％酒精脱色，约30s，或将酒精滴满整个涂片，立即倾去，再用酒精滴满整个涂片，脱色10s，水洗。
2.6.2.4 滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。
2.6.3染色结果
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
注：如用1:10稀释石碳酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。
3 仪器
3.1 恒温水浴或隔水式恒温箱：44℃。
3.2 温度计。
3.3 显微镜。
3.4 载玻片。
3.5 接种环。
3.6 电炉。
3.7 锥形瓶。
3.8 试管。
3.9 小倒管。
3.10 pH计或pH试纸。
3.11 高压消毒锅。
3.12 灭菌吸管。
3.13 灭菌平皿。
4 操作步骤
4.1 取10ml1:10稀释的样品，加到10ml双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44℃培养箱中培养24~48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。
4.2 如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置于37℃培养18~24h。同时取该培养液1~2滴接种到蛋白胨水中，置44℃培养24h。
经培养后，在上述平板上观察有无碘型菌落生长。大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落。亦常为大肠菌群，均应注意挑选。
4.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。
4.4 在蛋白胨水培养基中，加入靛基质试剂约0.5ml，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。
5 检验结果报告
平面上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
附加说明：
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。
本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。
本标准主要起草人周淑玉。
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。
